MitoLite 線粒體紅色熒光探針是一種陽離子染料，可以通過線粒體膜電位梯度選擇性地積聚在線粒體中。線粒體指示劑是一種疏水性化合物，很容易透過完整的活細胞，并在進入細胞后被線粒體捕獲。這種熒光線粒體指示劑長時間保留在線粒體中，因為該指示劑帶有細胞保留基團。這一關(guān)鍵特性顯著提高了染色效率。它可以很容易地適用于各種熒光平臺，如微孔板分析，免疫細胞化學和流式細胞術(shù)。它適用于增殖和非增殖細胞，可用于懸浮細胞和貼壁細胞。

操作步驟

1.準備線粒體染色溶液：

1.1解凍MitoLite 染料至室溫。

1.2通過將20μL500X Mitolite 染料稀釋到10 mL Hanks和20 mm Hepes緩沖液或緩沖液（HBSS）中，制備染料工作溶液。

注1：20μLMitolite 染料足以用于一個96孔板。 在<-15℃下分裝并儲存未使用的MitoLite 染料儲備溶液。 保護它免受光照，避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注2：熒光線粒體指示劑的最佳濃度根據(jù)具體應(yīng)用而變化。 可以根據(jù)特定細胞類型和細胞或組織對探針的滲透性來修改染色條件。

2.準備和染色細胞：

2.1對于貼壁細胞：a.在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上培養(yǎng)細胞。當細胞達到所需的匯合時，加入等體積的染料工作溶液（來自步驟1.2）。 b.將細胞在37oC，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時。 c.用預(yù)熱（37oC）Hanks和20 mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液（例如濃度為1：1的生長培養(yǎng)基緩沖液）替換染料加載溶液或清洗（特別是對于＃22679）細胞。用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細胞孔。 d.使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細胞。

注意：如果細胞看起來沒有充分染色，建議增加標記濃度或孵育時間以使染料積累。

2.2對于懸浮細胞：將細胞以1000rpm離心5分鐘以獲得細胞沉淀并吸出上清液。在預(yù)熱（37℃）生長培養(yǎng)基中輕輕重懸細胞沉淀，并加入等體積的染料加工溶液（來自步驟1.2）。將細胞在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30分鐘至2小時。用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或緩沖液替換染料加載溶液或洗滌（特別是對于＃22679）。（例如生長培養(yǎng)基濃度為1：1的緩沖液）。用HBSS或生長培養(yǎng)基填充細胞孔。使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀察細胞。

注1：如果細胞看起來沒有充分染色，建議增加標記濃度或培養(yǎng)時間以使染料積累。

注2：懸浮細胞可以附著在用BD Cell-Tak?（BD Biosciences）處理過的蓋玻片上，并作為粘附細胞染色（見步驟2.1）。